Quelltext der Seite Polymerase chain reaction

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[[Image:PCR tubes.png|thumb|A strip of eight PCR tubes, each containing a 100&nbsp;μL reaction mixture]]
[[Image:PCR masina kasutamine.jpg|thumb|Placing a strip of eight PCR tubes into a thermal cycler]]

Die "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) ist eine weit verbreitete Methode, um schnell Millionen bis Milliarden Kopien einer bestimmten DNA-Probe herzustellen. So können Wissenschaftler eine sehr kleine DNA-Probe (oder einen Teil davon) so weit vervielfältigen, dass eine detaillierte Untersuchung möglich ist. Die PCR wurde 1983 vom amerikanischen Biochemiker Kary Mullis bei der Cetus Corporation erfunden. Mullis und der Biochemiker Michael Smith, der andere wichtige Methoden zur DNA-Manipulation entwickelt hatte, wurden 1993 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Die PCR ist für viele Verfahren in der Gentest- und Genforschungsbranche von grundlegender Bedeutung, darunter die Analyse alter DNA-Proben und die Identifizierung von Infektionserregern. Mit der PCR werden Kopien sehr kleiner Mengen von DNA-Sequenzen in einer Reihe von Zyklen mit Temperaturänderungen exponentiell vervielfältigt. Die PCR ist heute eine gängige und oft unverzichtbare Technik, die in der medizinischen Laborforschung für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt wird, darunter in der biomedizinischen Forschung und in der Forensik.

Die meisten PCR-Methoden basieren auf dem Thermocycling. Beim Thermocycling werden die Reagenzien wiederholten Zyklen von Erhitzen und Abkühlen ausgesetzt, um verschiedene temperaturabhängige Reaktionen zu ermöglichen – insbesondere das Schmelzen der DNA und die enzymgesteuerte DNA-Replikation. Bei der PCR werden zwei Hauptreagenzien verwendet: Primer (kurze Einzelstrang-DNA-Fragmente, sogenannte Oligonukleotide, die eine komplementäre Sequenz zur Ziel-DNA-Region aufweisen) und eine thermostabile DNA-Polymerase. Im ersten Schritt der PCR werden die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix bei hoher Temperatur in einem Prozess, der als Nukleinsäure-Denaturierung bezeichnet wird, physisch getrennt. Im zweiten Schritt wird die Temperatur gesenkt und die Primer binden sich an die komplementären DNA-Sequenzen. Die beiden DNA-Stränge werden dann zu Matrizen für die DNA-Polymerase, die aus freien Nukleotiden, den Bausteinen der DNA, enzymatisch einen neuen DNA-Strang zusammensetzt. Im Verlauf der PCR wird die erzeugte DNA selbst als Matrize für die Replikation verwendet, wodurch eine Kettenreaktion in Gang gesetzt wird, bei der die ursprüngliche DNA-Matrize exponentiell vervielfältigt wird.

Bei fast allen PCR-Anwendungen wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet, wie z. B. die Taq-Polymerase, ein Enzym, das ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium "Thermus aquaticus" isoliert wurde. Wenn die verwendete Polymerase hitzeempfindlich wäre, würde sie unter den hohen Temperaturen des Denaturierungsschritts denaturieren. Vor der Verwendung der "Taq"-Polymerase musste die DNA-Polymerase bei jedem Zyklus manuell hinzugefügt werden, was ein langwieriger und kostspieliger Prozess war.

Zu den Anwendungsbereichen dieser Technik gehören die DNA-Klonierung für die Sequenzierung, die Genklonierung und -manipulation, die Genmutagenese, die Erstellung von DNA-basierten Phylogenien oder die Funktionsanalyse von Genen, die Diagnose und Überwachung genetischer Störungen, die Amplifikation alter DNA, die Analyse genetischer Fingerabdrücke für die DNA-Profilierung (z. B. in der Forensik und bei Abstammungstests) und der Nachweis von Krankheitserregern in Nukleinsäuretests zur Diagnose von Infektionskrankheiten.

==Grundsätze==
[[File:Primitive PCR machine for scrap.JPG|thumb|upright|An older, three-temperature thermal cycler for PCR]]

Die PCR vervielfältigt einen bestimmten Bereich eines DNA-Strangs (das DNA-Ziel). Die meisten PCR-Methoden vervielfältigen DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 0,1 und 10 Kilobasenpaaren (kbp), obwohl einige Techniken die Vervielfältigung von Fragmenten mit einer Länge von bis zu 40 kbp ermöglichen. Die Menge des vervielfältigten Produkts wird durch die verfügbaren Substrate in der Reaktion bestimmt, die mit fortschreitender Reaktion begrenzt wird.

Ein grundlegender PCR-Aufbau erfordert mehrere Komponenten und Reagenzien, darunter:
* eine "DNA-Vorlage", die die zu amplifizierende DNA-Zielregion enthält
* eine "DNA-Polymerase", ein Enzym, das neue DNA-Stränge polymerisiert; hitzebeständige Taq-Polymerase ist besonders verbreitet, da sie während des Hochtemperatur-DNA-Denaturierungsprozesses eher intakt bleibt
* zwei DNA-"Primer", die komplementär zu den 3'- (drei Primer) Enden jedes der Sense- und Antisense-Stränge des DNA-Ziels komplementär sind (DNA-Polymerase kann nur an eine doppelsträngige DNA-Region binden und sich von dieser aus verlängern; ohne Primer gibt es keine doppelsträngige Initiationsstelle, an die die Polymerase binden kann); spezifische Primer, die zur DNA-Zielregion komplementär sind, werden im Voraus ausgewählt und oft in einem Labor maßgeschneidert oder von kommerziellen Biochemie-Anbietern gekauft
* "Desoxynukleosidtriphosphate" oder dNTPs (manchmal auch als "Desoxynukleotidtriphosphate" bezeichnet; Nukleotide, die Triphosphatgruppen enthalten), die Bausteine, aus denen die DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang synthetisiert
* eine "Pufferlösung", die eine geeignete chemische Umgebung für eine optimale Aktivität und Stabilität der DNA-Polymerase bietet
"zweiwertige Kationen", typischerweise Magnesium- (Mg) oder Mangan- (Mn) Ionen; Mg<sup>2+</sup> ist am häufigsten, aber Mn<sup>2+</sup> kann für die PCR-vermittelte DNA-Mutagenese verwendet werden, da eine höhere Mn<sup>2+</sup>-Konzentration die Fehlerrate während der DNA-Synthese erhöht; und ‚einwertige Kationen‘, typischerweise Kalium- (K) Ionen

Die Reaktion wird üblicherweise in einem Volumen von 10–200 µl in kleinen Reaktionsgefäßen (0,2–0,5 ml Volumen) in einem Thermocycler durchgeführt. Der Thermocycler erwärmt und kühlt die Reaktionsgefäße, um die für jeden Reaktionsschritt erforderlichen Temperaturen zu erreichen (siehe unten). Viele moderne Thermocycler verwenden ein Peltier-Element, das sowohl das Heizen als auch das Kühlen des Blocks ermöglicht, der die PCR-Röhrchen enthält, indem einfach der elektrische Strom des Geräts umgekehrt wird. Dünnwandige Reaktionsgefäße ermöglichen eine günstige Wärmeleitfähigkeit, um ein schnelles thermisches Gleichgewicht zu ermöglichen. Die meisten Thermocycler haben beheizte Deckel, um Kondensation am oberen Ende des Reaktionsgefäßes zu verhindern. Bei älteren Thermocyclern ohne beheizten Deckel muss eine Ölschicht auf die Reaktionsmischung gegeben oder ein Wachskügelchen in das Reaktionsgefäß gegeben werden.

===Verfahren===
Normalerweise besteht die PCR aus einer Reihe von 20–40 wiederholten Temperaturänderungen, sogenannten thermischen Zyklen, wobei jeder Zyklus in der Regel aus zwei oder drei diskreten Temperaturschritten besteht (siehe Abbildung unten). Dem Zyklus geht oft ein einzelner Temperaturschritt bei einer sehr hohen Temperatur (>{{convert|90|°C|°F}}) voraus, und am Ende folgt eine Haltephase für die endgültige Produktverlängerung oder kurze Lagerung. Die verwendeten Temperaturen und die Dauer ihrer Anwendung in jedem Zyklus hängen von einer Vielzahl von Parametern ab, darunter das für die DNA-Synthese verwendete Enzym, die Konzentration der zweiwertigen Ionen und dNTPs in der Reaktion und die Schmelztemperatur (T<sub>m</sub>) der Primer. Die einzelnen Schritte, die den meisten PCR-Methoden gemeinsam sind, sind wie folgt:
* "Initialisierung": Dieser Schritt ist nur für DNA-Polymerasen erforderlich, die eine Wärmeaktivierung durch Hot-Start-PCR benötigen. Er besteht aus dem Erhitzen der Reaktionskammer auf eine Temperatur von {{convert|94|–|96|°C|°F}} oder {{convert|98|°C|°F}}, wenn extrem thermostabile Polymerasen verwendet werden, die dann für 1–10 Minuten gehalten wird.
* "Denaturierung": Dieser Schritt ist der erste reguläre Zyklus und besteht darin, die Reaktionskammer für 20–30 Sekunden auf {{convert|94|–|98|°C|°F}} zu erhitzen. Dies führt zum Schmelzen der DNA oder zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Vorlage, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen aufgebrochen werden, wodurch zwei einzelsträngige DNA-Moleküle entstehen.
* "Annealing": Im nächsten Schritt wird die Reaktionstemperatur für 20–40 Sekunden auf {{convert|50|–|65|°C|°F}} gesenkt, sodass die Primer an jede der einzelsträngigen DNA-Matrizen binden können. In der Reaktionsmischung sind normalerweise zwei verschiedene Primer enthalten: einer für jedes der beiden einzelsträngigen Komplemente, die die Zielregion enthalten. Die Primer sind selbst einzelsträngige Sequenzen, aber viel kürzer als die Länge der Zielregion und ergänzen nur sehr kurze Sequenzen am 3'-Ende jedes Strangs.

Es ist wichtig, eine geeignete Temperatur für den Annealing-Schritt zu bestimmen, da Effizienz und Spezifität stark von der Annealing-Temperatur beeinflusst werden. Diese Temperatur muss niedrig genug sein, um die Hybridisierung des Primers an den Strang zu ermöglichen, aber hoch genug, damit die Hybridisierung spezifisch ist, d. h. der Primer sollte "nur" an einen perfekt komplementären Teil des Strangs binden und nirgendwo anders. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, kann der Primer unvollständig binden. Wenn sie zu hoch ist, kann der Primer überhaupt nicht binden. Eine typische Annealingtemperatur liegt etwa 3–5 °C unter dem "T<sub>m</sub>" der verwendeten Primer. Stabile Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen werden nur gebildet, wenn die Primersequenz sehr genau mit der Matrizensequenz übereinstimmt. Während dieses Schritts bindet die Polymerase an das Primer-Matrizen-Hybrid und beginnt mit der DNA-Bildung.
* "Extension/Elongation": Die Temperatur bei diesem Schritt hängt von der verwendeten DNA-Polymerase ab; die optimale Aktivitätstemperatur für die thermostabile DNA-Polymerase der "Taq"-Polymerase liegt bei etwa {{convert|75|–|80|°C|°F}}, obwohl für dieses Enzym üblicherweise eine Temperatur von {{convert|72|°C|°F}} verwendet wird. In diesem Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang, der komplementär zum DNA-Vorlage-Strang ist, indem sie freie dNTPs aus der Reaktionsmischung hinzufügt, die komplementär zur Vorlage in 5'-zu-3'-Richtung sind, und die 5'-Phosphatgruppe der dNTPs mit der 3'-Hydroxygruppe am Ende des entstehenden (verlängerten) DNA-Strangs kondensiert. Die genaue Zeit, die für die Verlängerung benötigt wird, hängt sowohl von der verwendeten DNA-Polymerase als auch von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Zielregion ab. Als Faustregel gilt, dass die meisten DNA-Polymerasen bei ihrer optimalen Temperatur tausend Basen pro Minute polymerisieren. Unter optimalen Bedingungen (d. h. wenn es keine Einschränkungen aufgrund begrenzter Substrate oder Reagenzien gibt) wird bei jedem Verlängerungs-/Elongationsschritt die Anzahl der DNA-Zielsequenzen verdoppelt. Mit jedem aufeinanderfolgenden Zyklus werden die ursprünglichen Matrizenstränge plus alle neu erzeugten Stränge zu Matrizensträngen für die nächste Verlängerungsrunde, was zu einer exponentiellen (geometrischen) Amplifikation der spezifischen DNA-Zielregion führt.

: Die Prozesse der Denaturierung, des Annealings und der Verlängerung bilden einen einzigen Zyklus. Es sind mehrere Zyklen erforderlich, um die DNA-Zielregion auf Millionen von Kopien zu vervielfältigen. Die Formel zur Berechnung der Anzahl der nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen gebildeten DNA-Kopien lautet 2<sup>n</sup>, wobei "n" die Anzahl der Zyklen ist. Eine Reaktion, die auf 30 Zyklen eingestellt ist, führt also zu 2<sup>30</sup> oder {{formatnum:{{#expr:2^30}}}} Kopien der ursprünglichen doppelsträngigen DNA-Zielregion.
* "Final elongation" (Endverlängerung): Dieser einzelne Schritt ist optional, wird jedoch bei einer Temperatur von {{convert|70|–|74|°C|°F}} (der Temperaturbereich, der für eine optimale Aktivität der meisten in der PCR verwendeten Polymerasen erforderlich ist) für 5–15 Minuten nach dem letzten PCR-Zyklus durchgeführt, um sicherzustellen, dass die verbleibende einzelsträngige DNA vollständig verlängert wird.
* "Final hold": Der letzte Schritt kühlt die Reaktionskammer auf {{convert|4|–|15|°C|°F}} für unbestimmte Zeit ab und kann zur kurzfristigen Lagerung der PCR-Produkte verwendet werden.

[[File:Polymerase chain reaction-en.svg|frameless|center|Schematic drawing of a complete PCR cycle|1024x438px]]
[[Image:Roland Gel.JPG|thumb|Ethidium bromide-stained PCR products after gel electrophoresis. Two sets of primers were used to amplify a target sequence from three different tissue samples. No amplification is present in sample #1; DNA bands in sample #2 and #3 indicate successful amplification of the target sequence. The gel also shows a positive control, and a DNA ladder containing DNA fragments of defined length for sizing the bands in the experimental PCRs.]]
Um zu überprüfen, ob die PCR erfolgreich die erwartete DNA-Zielregion (manchmal auch als Amplimer oder Amplikon bezeichnet) erzeugt hat, kann eine Agarose-Gelelektrophorese zur Größentrennung der PCR-Produkte eingesetzt werden. Die Größe der PCR-Produkte wird durch den Vergleich mit einer DNA-Leiter bestimmt, einem Molekulargewichtsmarker, der DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und neben den PCR-Produkten auf dem Gel läuft.
[[File:Tucker PCR.png|center|Tucker PCR]]

===Stufen===
[[File:Exponential Amplification.svg|thumb|upright=1.3|Exponential amplification]]
Wie bei anderen chemischen Reaktionen werden die Reaktionsgeschwindigkeit und die Effizienz der PCR durch begrenzende Faktoren beeinflusst. Daher kann der gesamte PCR-Prozess basierend auf dem Reaktionsfortschritt in drei Phasen unterteilt werden:
Exponentielle Amplifikation: Bei jedem Zyklus verdoppelt sich die Produktmenge (bei einer angenommenen Reaktionseffizienz von 100 %). Nach 30 Zyklen kann eine einzelne DNA-Kopie auf bis zu 1.000.000.000 (eine Milliarde) Kopien erhöht werden. In gewisser Weise wird also die Replikation eines einzelnen DNA-Strangs in einem Reagenzglas unter kontrollierten Bedingungen manipuliert. Die Reaktion ist sehr empfindlich: Es müssen nur winzige Mengen an DNA vorhanden sein.
* "Leveling off stage": Die Reaktion verlangsamt sich, da die DNA-Polymerase an Aktivität verliert und der Verbrauch von Reagenzien wie dNTPs und Primern dazu führt, dass diese knapper werden.
* "Plateau": Aufgrund der Erschöpfung von Reagenzien und Enzymen sammelt sich kein Produkt mehr an.

==Optimierung==

In der Praxis kann die PCR aus verschiedenen Gründen fehlschlagen, z. B. aufgrund von Empfindlichkeit oder Kontamination. Eine "Kontamination" mit Fremd-DNA kann zu falschen Produkten führen und wird durch Laborprotokolle und -verfahren behandelt, die Prä-PCR-Gemische von potenziellen DNA-Kontaminanten trennen. Wenn beispielsweise DNA von einem Tatort analysiert wird, könnte ein einzelnes DNA-Molekül des Laborpersonals amplifiziert werden und die Untersuchung in die falsche Richtung lenken. Daher wird der PCR-Aufbau von der Analyse oder Reinigung anderer PCR-Produkte getrennt, es werden Einweg-Plastikartikel verwendet und die Arbeitsfläche zwischen den Reaktionsaufbauten muss gründlich gereinigt werden.

Die "Spezifität" kann durch experimentelle Bedingungen so angepasst werden, dass keine unerwünschten Produkte entstehen. Techniken zur Primer-Gestaltung sind wichtig, um die PCR-Produktausbeute zu verbessern und die Bildung unspezifischer Produkte zu vermeiden. Die Verwendung alternativer Pufferkomponenten oder Polymeraseenzyme kann bei der Amplifikation langer oder anderweitig problematischer DNA-Regionen helfen. So soll beispielsweise die Q5-Polymerase ≈280-mal weniger fehleranfällig sein als die Taq-Polymerase. Sowohl die Laufparameter (z. B. Temperatur und Dauer der Zyklen) als auch die Zugabe von Reagenzien wie Formamid können die Spezifität und Ausbeute der PCR erhöhen. Computersimulationen theoretischer PCR-Ergebnisse (elektronische PCR) können durchgeführt werden, um das Primerdesign zu unterstützen.

==Anwendungen==

===Selektive DNA-Isolierung===
Die PCR ermöglicht die Isolierung von DNA-Fragmenten aus genomischer DNA durch selektive Amplifikation eines bestimmten DNA-Abschnitts. Diese Anwendung der PCR bietet zahlreiche Vorteile, z. B. bei der Herstellung von Hybridisierungssonden für die Southern- oder Northern-Hybridisierung und die DNA-Klonierung, für die größere Mengen an DNA erforderlich sind, die einen bestimmten DNA-Abschnitt repräsentieren. Die PCR liefert für diese Techniken große Mengen an reiner DNA, sodass DNA-Proben selbst aus sehr geringen Mengen an Ausgangsmaterial analysiert werden können.

Weitere Anwendungsbereiche der PCR sind die DNA-Sequenzierung zur Bestimmung unbekannter PCR-amplifizierter Sequenzen, bei denen einer der Amplifikationsprimer in der Sanger-Sequenzierung verwendet werden kann, die Isolierung einer DNA-Sequenz zur Beschleunigung rekombinanter DNA-Technologien, bei denen eine DNA-Sequenz in ein Plasmid, einen Phagen oder ein Cosmid (je nach Größe) oder das genetische Material eines anderen Organismus eingefügt wird. Bakterienkolonien (wie E. coli) können mittels PCR schnell auf korrekte DNA-Vektorkonstrukte untersucht werden. PCR kann auch für den genetischen Fingerabdruck verwendet werden, eine forensische Technik, die zur Identifizierung einer Person oder eines Organismus durch den Vergleich experimenteller DNAs mit verschiedenen PCR-basierten Methoden eingesetzt wird.

[[File:Pcr fingerprint.png|thumb|upright|Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments: {{Ordered list|Father|Child|Mother}}<br />The child has inherited some, but not all, of the fingerprints of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.]]

Einige PCR-Fingerabdruckmethoden haben eine hohe Unterscheidungskraft und können zur Identifizierung genetischer Beziehungen zwischen Individuen, wie Eltern-Kind oder zwischen Geschwistern, verwendet werden und werden bei Vaterschaftstests eingesetzt (Abb. 4). Diese Technik kann auch zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen verwendet werden, wenn bestimmte molekulare Uhren verwendet werden (d. h. die 16S rRNA- und recA-Gene von Mikroorganismen).

===Amplifikation und Quantifizierung von DNA===

Da die PCR die Zielregionen der DNA amplifiziert, kann sie zur Analyse extrem kleiner Probenmengen verwendet werden. Dies ist oft entscheidend für forensische Analysen, bei denen nur eine geringe Menge an DNA als Beweis zur Verfügung steht. PCR kann auch bei der Analyse von alter DNA, die Zehntausende von Jahren alt ist, eingesetzt werden. Diese PCR-basierten Techniken wurden erfolgreich bei Tieren, wie z. B. einem vierzigtausend Jahre alten Mammut, und auch bei menschlicher DNA eingesetzt, und zwar in Anwendungen, die von der Analyse ägyptischer Mumien bis hin zur Identifizierung eines russischen Zaren und der Leiche des englischen Königs Richard III. reichen.

Quantitative PCR- oder Real Time PCR-Methoden (qPCR, nicht zu verwechseln mit RT-PCR) ermöglichen die Schätzung der Menge einer bestimmten Sequenz in einer Probe – eine Technik, die häufig zur quantitativen Bestimmung der Genexpression eingesetzt wird. Die quantitative PCR ist ein etabliertes Werkzeug zur DNA-Quantifizierung, das die Akkumulation des DNA-Produkts nach jeder PCR-Amplifikationsrunde misst.

Die qPCR ermöglicht die Quantifizierung und den Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz in Echtzeit, da sie die Konzentration misst, während der Syntheseprozess stattfindet. Es gibt zwei Methoden für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung. Die erste Methode besteht in der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die unspezifisch zwischen den Doppelsträngen zurückgehalten werden. Die zweite Methode beinhaltet Sonden, die für spezifische Sequenzen kodieren und fluoreszierend markiert sind. Der Nachweis von DNA mit diesen Methoden kann erst nach der Hybridisierung der Sonden mit ihrer komplementären DNA (cDNA) erfolgen. Eine interessante Kombination von Techniken ist die Echtzeit-PCR und die reverse Transkription. Diese hochentwickelte Technik, die als RT-qPCR bezeichnet wird, ermöglicht die Quantifizierung einer kleinen Menge an RNA. Durch diese kombinierte Technik wird mRNA in cDNA umgewandelt, die dann mittels qPCR weiter quantifiziert wird. Diese Technik senkt die Wahrscheinlichkeit von Fehlern am Endpunkt der PCR und erhöht die Chancen, Gene zu erkennen, die mit genetischen Krankheiten wie Krebs in Verbindung stehen. Labore verwenden RT-qPCR zur sensitiven Messung der Genregulation. Die mathematischen Grundlagen für die zuverlässige Quantifizierung der PCR und RT-qPCR erleichtern die Umsetzung von Verfahren zur genauen Anpassung experimenteller Daten in der Forschung, Medizin, Diagnostik und bei Infektionskrankheiten.

===Medizinische und diagnostische Anwendungen===
Potenzielle Eltern können auf eine mögliche genetische Veranlagung getestet werden, oder ihre Kinder können auf eine tatsächliche Erkrankung untersucht werden. DNA-Proben für pränatale Tests können durch Amniozentese, Chorionzottenbiopsie oder sogar durch die Analyse seltener fetaler Zellen, die im Blutkreislauf der Mutter zirkulieren, gewonnen werden. Die PCR-Analyse ist auch für die genetische Präimplantationsdiagnostik von entscheidender Bedeutung, bei der einzelne Zellen eines sich entwickelnden Embryos auf Mutationen untersucht werden.
* Die PCR kann auch als Teil eines sensiblen Tests zur Gewebetypisierung verwendet werden, der für die Organtransplantation von entscheidender Bedeutung ist. Es gibt sogar einen Vorschlag, die herkömmlichen antikörperbasierten Tests zur Bestimmung der Blutgruppe durch PCR-basierte Tests zu ersetzen.
* Viele Krebsformen gehen mit Veränderungen an "Onkogenen" einher.  Durch die Verwendung PCR-basierter Tests zur Untersuchung dieser Mutationen können Therapieschemata manchmal individuell auf einen Patienten zugeschnitten werden. Die PCR ermöglicht die frühzeitige Diagnose bösartiger Erkrankungen wie Leukämie und Lymphome, die derzeit am weitesten in der Krebsforschung entwickelt ist und bereits routinemäßig eingesetzt wird. PCR-Assays können direkt an genomischen DNA-Proben durchgeführt werden, um translokationsspezifische maligne Zellen mit einer Empfindlichkeit zu erkennen, die mindestens 10.000-mal höher ist als bei anderen Methoden. Die PCR ist im medizinischen Bereich sehr nützlich, da sie die Isolierung und Amplifikation von Tumorsuppressoren ermöglicht. Die quantitative PCR kann beispielsweise zur Quantifizierung und Analyse einzelner Zellen sowie zur Erkennung von DNA-, mRNA- und Proteinbestätigungen und -kombinationen verwendet werden.

===Anwendungen bei Infektionskrankheiten===
Die PCR ermöglicht eine schnelle und hochspezifische Diagnose von Infektionskrankheiten, einschließlich solcher, die durch Bakterien oder Viren verursacht werden. Die PCR ermöglicht auch die Identifizierung von nicht kultivierbaren oder langsam wachsenden Mikroorganismen wie Mykobakterien, anaeroben Bakterien oder Viren aus Gewebekultur-Assays und Tiermodellen. Die Grundlage für PCR-Diagnoseanwendungen in der Mikrobiologie ist der Nachweis von Infektionserregern und die Unterscheidung von nicht pathogenen und pathogenen Stämmen anhand spezifischer Gene.

Die Charakterisierung und Erkennung von Organismen, die Infektionskrankheiten verursachen, wurde durch die PCR auf folgende Weise revolutioniert:
Das "Humane Immundefizienz-Virus" (oder "HIV") ist ein schwer zu findendes und zu bekämpfendes Ziel. Die ersten Infektionstests beruhten auf dem Nachweis von Antikörpern gegen das Virus, die im Blutkreislauf zirkulieren.  Antikörper treten jedoch erst viele Wochen nach der Infektion auf, mütterliche Antikörper verschleiern die Infektion eines Neugeborenen und therapeutische Mittel zur Bekämpfung der Infektion wirken sich nicht auf die Antikörper aus.  Es wurden PCR-Tests entwickelt, die bereits ein einziges Virusgenom in der DNA von über 50.000 Wirtszellen nachweisen können. Infektionen können früher erkannt werden, gespendetes Blut kann direkt auf das Virus untersucht werden, Neugeborene können sofort auf eine Infektion getestet werden und die Auswirkungen antiviraler Behandlungen können quantifiziert werden.
* Einige Krankheitserreger, wie z. B. der Erreger der Tuberkulose, lassen sich nur schwer von Patienten entnehmen und im Labor nur langsam züchten.  PCR-basierte Tests ermöglichen den Nachweis einer geringen Anzahl von Krankheitserregern (sowohl lebend als auch tot) in geeigneten Proben.  Eine detaillierte genetische Analyse kann auch zur Erkennung von Antibiotikaresistenzen eingesetzt werden, was eine sofortige und wirksame Therapie ermöglicht.  Die Auswirkungen der Therapie können ebenfalls sofort bewertet werden.
* Die Ausbreitung eines Krankheitserregers in Populationen von Haus- oder Wildtieren kann durch PCR-Tests überwacht werden.  In vielen Fällen kann das Auftreten neuer virulenter Subtypen erkannt und überwacht werden.  Die Subtypen eines Organismus, die für frühere Epidemien verantwortlich waren, können ebenfalls durch PCR-Analyse bestimmt werden.
Virale DNA kann durch PCR nachgewiesen werden. Die verwendeten Primer müssen spezifisch für die Zielsequenzen in der DNA eines Virus sein, und PCR kann für diagnostische Analysen oder die DNA-Sequenzierung des viralen Genoms verwendet werden. Die hohe Empfindlichkeit der PCR ermöglicht den Virusnachweis kurz nach der Infektion und sogar vor dem Ausbruch der Krankheit. Eine solche Früherkennung kann Ärzten einen erheblichen zeitlichen Vorsprung bei der Behandlung verschaffen. Die Virusmenge ("Viruslast") in einem Patienten kann auch durch PCR-basierte DNA-Quantifizierungstechniken (siehe unten) quantifiziert werden. Eine Variante der PCR (RT-PCR) wird zum Nachweis viraler RNA anstelle von DNA verwendet: Bei diesem Test wird das Enzym Reverse Transkriptase verwendet, um eine DNA-Sequenz zu erzeugen, die mit der viralen RNA übereinstimmt; diese DNA wird dann gemäß der üblichen PCR-Methode amplifiziert. RT-PCR wird häufig zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virusgenoms eingesetzt.
* Krankheiten wie Keuchhusten (oder Pertussis) werden durch das Bakterium "Bordetella pertussis" verursacht. Dieses Bakterium ist für eine schwere akute Atemwegsinfektion verantwortlich, die verschiedene Tiere und Menschen befällt und zum Tod vieler Kleinkinder geführt hat. Das Pertussis-Toxin ist ein Protein-Exotoxin, das sich über zwei Dimere an Zellrezeptoren bindet und mit verschiedenen Zelltypen wie T-Lymphozyten reagiert, die eine Rolle bei der zellulären Immunität spielen. Die PCR ist ein wichtiges Testverfahren, mit dem Sequenzen innerhalb des Gens für das Pertussis-Toxin nachgewiesen werden können.  Da die PCR eine hohe Empfindlichkeit für das Toxin und eine schnelle Durchlaufzeit aufweist, ist sie im Vergleich zur Kultur sehr effizient für die Diagnose von Pertussis.

===Forensische Anwendungen===
Die Entwicklung von PCR-basierten genetischen (oder DNA-) Fingerabdruckprotokollen hat in der Forensik eine breite Anwendung gefunden:
* [[File:US Army CID agents at crime scene.jpg|thumb|DNA samples are often taken at crime scenes and analyzed by PCR.]]In seiner differenziertesten Form kann der "genetische Fingerabdruck" jede beliebige Person eindeutig von der gesamten Weltbevölkerung unterscheiden.  Von einem Tatort können winzige DNA-Proben isoliert und mit denen von Verdächtigen oder aus einer DNA-Datenbank früherer Beweise oder Verurteilter verglichen werden.  Einfachere Versionen dieser Tests werden häufig eingesetzt, um Verdächtige während einer strafrechtlichen Ermittlung schnell auszuschließen.  Beweise aus jahrzehntealten Verbrechen können getestet werden, um die ursprünglich verurteilten Personen zu bestätigen oder zu entlasten.
* Die forensische DNA-Typisierung ist eine effektive Methode zur Identifizierung oder Entlastung von Tatverdächtigen durch die Analyse von Beweisen, die am Tatort entdeckt wurden. Das menschliche Genom weist viele repetitive Regionen auf, die in Gensequenzen oder in nicht-kodierenden Regionen des Genoms zu finden sind.  Insbesondere sind bis zu 40 % der menschlichen DNA repetitiv. Diese repetitiven, nicht-kodierenden Regionen im Genom lassen sich in zwei verschiedene Kategorien unterteilen. Die erste Kategorie wird als variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen (VNTR) bezeichnet, die 10–100 Basenpaare lang sind, und die zweite Kategorie wird als kurze Tandem-Wiederholungen (STR) bezeichnet, die aus wiederholten Abschnitten von 2–10 Basenpaaren bestehen.  Die PCR wird verwendet, um mehrere bekannte VNTRs und STRs mithilfe von Primern zu amplifizieren, die jede der repetitiven Regionen flankieren. Die Größe der Fragmente, die von jedem Individuum für jeden der STRs erhalten werden, zeigt an, welche Allele vorhanden sind. Durch die Analyse mehrerer STRs für ein Individuum wird eine Reihe von Allelen für jede Person gefunden, die statistisch gesehen wahrscheinlich einzigartig sind. Forscher haben die vollständige Sequenz des menschlichen Genoms identifiziert. Diese Sequenz kann über die NCBI-Website leicht abgerufen werden und wird in vielen realen Anwendungen verwendet. Das FBI hat beispielsweise eine Reihe von DNA-Markerstellen zusammengestellt, die zur Identifizierung verwendet werden und als DNA-Datenbank des Combined DNA Index System (CODIS) bezeichnet werden. Mithilfe dieser Datenbank kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass eine DNA-Probe übereinstimmt.  Die PCR ist ein sehr leistungsfähiges und bedeutendes analytisches Werkzeug für die forensische DNA-Typisierung, da Forscher nur eine sehr geringe Menge der Ziel-DNA für die Analyse benötigen. So enthält beispielsweise ein einzelnes menschliches Haar mit Haarfollikel genügend DNA für die Analyse. Auch einige Spermien, Hautproben unter den Fingernägeln oder eine kleine Menge Blut können genügend DNA für eine aussagekräftige Analyse liefern.
* Weniger anspruchsvolle Formen des DNA-Fingerabdrucks können bei "DNA-Vaterschaftstests" helfen, bei denen eine Person mit ihren nahen Verwandten abgeglichen wird.  DNA von nicht identifizierten menschlichen Überresten kann getestet und mit der von möglichen Eltern, Geschwistern oder Kindern verglichen werden.  Ähnliche Tests können verwendet werden, um die biologischen Eltern eines adoptierten (oder entführten) Kindes zu bestätigen.  Der tatsächliche biologische Vater eines Neugeborenen kann ebenfalls bestätigt (oder ausgeschlossen) werden.
* Das PCR-AMGX/AMGY-Design erleichtert die Amplifikation von DNA-Sequenzen aus einer sehr geringen Menge des Genoms. Es kann jedoch auch zur Echtzeit-Geschlechtsbestimmung aus forensischen Knochenproben verwendet werden. Dies bietet eine leistungsstarke und effektive Möglichkeit, das Geschlecht in forensischen Fällen und bei alten Proben zu bestimmen.

=== Forschungsanwendungen
Die PCR wurde in vielen Bereichen der molekulargenetischen Forschung eingesetzt:
* Die PCR ermöglicht die schnelle Produktion kurzer DNA-Stücke, selbst wenn nicht mehr als die Sequenz der beiden Primer bekannt ist.  Diese Fähigkeit der PCR erweitert viele Methoden, wie z. B. die Erzeugung von "Hybridisierungssonden" für die Southern- oder Northern-Blot-Hybridisierung.  Die PCR versorgt diese Techniken mit großen Mengen reiner DNA, manchmal als Einzelstrang, sodass selbst sehr geringe Mengen an Ausgangsmaterial analysiert werden können.
* Auch die "DNA-Sequenzierung" kann durch PCR unterstützt werden. Bekannte DNA-Abschnitte können leicht von einem Patienten mit einer genetischen Mutation gewonnen werden. Durch Modifikationen der Amplifikationstechnik können Segmente aus einem völlig unbekannten Genom extrahiert oder nur ein einzelner Strang eines bestimmten Bereichs erzeugt werden.
* Die PCR hat zahlreiche Anwendungen für das traditionellere Verfahren der "DNA-Klonierung".  Sie kann Segmente zur Insertion in einen Vektor aus einem größeren Genom extrahieren, das möglicherweise nur in geringen Mengen verfügbar ist.  Mit einem einzigen Satz von "Vektor-Primern" kann sie auch Fragmente analysieren oder extrahieren, die bereits in Vektoren eingefügt wurden.  Einige Änderungen am PCR-Protokoll können "Mutationen" (allgemein oder ortsgebunden) eines eingefügten Fragments erzeugen.
"Sequence-tagged sites" ist ein Verfahren, bei dem die PCR als Indikator dafür verwendet wird, dass ein bestimmtes Segment eines Genoms in einem bestimmten Klon vorhanden ist.  Das Humangenomprojekt fand diese Anwendung für die Kartierung der Cosmid-Klone, die sie sequenzierten, und für die Koordinierung der Ergebnisse aus verschiedenen Laboren unerlässlich.
* Eine Anwendung der PCR ist die phylogenetische Analyse von DNA aus "antiken Quellen", wie sie in den geborgenen Knochen von Neandertalern, in gefrorenem Mammutgewebe oder im Gehirn ägyptischer Mumien gefunden wurde. In einigen Fällen kann die stark degradierte DNA aus diesen Quellen in den frühen Phasen der Amplifikation wieder zusammengesetzt werden.
* Eine häufige Anwendung der PCR ist die Untersuchung von Mustern der "Genexpression".  Gewebe (oder sogar einzelne Zellen) können in verschiedenen Stadien analysiert werden, um zu sehen, welche Gene aktiv geworden sind oder welche ausgeschaltet wurden.  Diese Anwendung kann auch die quantitative PCR verwenden, um die tatsächlichen Expressionsniveaus zu quantifizieren.
* Die Fähigkeit der PCR, mehrere Loci aus einzelnen Spermien gleichzeitig zu amplifizieren, hat die traditionellere Aufgabe der "genetischen Kartierung" durch die Untersuchung von chromosomalen Crossovers nach der Meiose erheblich verbessert.  Seltene Crossover-Ereignisse zwischen sehr nahen Loci wurden durch die Analyse Tausender einzelner Spermien direkt beobachtet.  Ebenso können ungewöhnliche Deletionen, Insertionen, Translokationen oder Inversionen analysiert werden, ohne dass man auf die langen und mühsamen Prozesse der Befruchtung, Embryogenese usw. warten (oder dafür bezahlen) muss.
* Gezielte Mutagenese: Mit PCR können mutierte Gene mit von Wissenschaftlern frei wählbaren Mutationen erzeugt werden.  Diese Mutationen können ausgewählt werden, um zu verstehen, wie Proteine ihre Funktionen erfüllen, und um die Proteinfunktion zu verändern oder zu verbessern.

== Vorteile ==
Die PCR hat eine Reihe von Vorteilen. Sie ist relativ einfach zu verstehen und anzuwenden und liefert schnell Ergebnisse. Die Technik ist hochsensibel und hat das Potenzial, Millionen bis Milliarden Kopien eines bestimmten Produkts für die Sequenzierung, Klonierung und Analyse zu produzieren. Die qRT-PCR hat dieselben Vorteile wie die PCR, mit dem zusätzlichen Vorteil der Quantifizierung des synthetisierten Produkts. Daher ist sie nützlich, um Veränderungen der Genexpressionsniveaus in Tumoren, Mikroben oder anderen Krankheitszuständen zu analysieren.

Die PCR ist ein sehr leistungsstarkes und praktisches Forschungsinstrument. Die Sequenzierung unbekannter Ursachen vieler Krankheiten wird durch die PCR herausgefunden. Die Technik kann dabei helfen, die Sequenz bisher unbekannter Viren zu identifizieren, die mit bereits bekannten Viren verwandt sind, und uns so ein besseres Verständnis der Krankheit selbst zu vermitteln. Wenn das Verfahren weiter vereinfacht werden kann und empfindliche nicht-radiometrische Detektionssysteme entwickelt werden können, wird die PCR in den kommenden Jahren einen herausragenden Platz im klinischen Labor einnehmen.

==Grenzen==
Eine wesentliche Einschränkung der PCR besteht darin, dass Vorabinformationen über die Zielsequenz erforderlich sind, um die Primer zu generieren, die eine selektive Amplifikation ermöglichen. Dies bedeutet, dass PCR-Anwender in der Regel die genaue(n) Sequenz(en) stromaufwärts der Zielregion auf jedem der beiden einzelsträngigen Matrizen kennen müssen, um sicherzustellen, dass die DNA-Polymerase ordnungsgemäß an die Primer-Matrizen-Hybride bindet und anschließend die gesamte Zielregion während der DNA-Synthese generiert.{{}}

Wie alle Enzyme sind auch DNA-Polymerasen fehleranfällig, was wiederum Mutationen in den erzeugten PCR-Fragmenten verursacht.

Eine weitere Einschränkung der PCR besteht darin, dass selbst die geringste Menge an kontaminierender DNA amplifiziert werden kann, was zu irreführenden oder mehrdeutigen Ergebnissen führt. Um das Risiko einer Kontamination zu minimieren, sollten die Forscher separate Räume für die Reagenzienvorbereitung, die PCR und die Produktanalyse reservieren. Reagenzien sollten in Einweg-Aliquots dosiert werden. Es sollten routinemäßig Pipetten mit Einwegkolben und extralangen Pipettenspitzen verwendet werden. Darüber hinaus wird empfohlen, sicherzustellen, dass die Laborausstattung einem Arbeitsablauf in einer Richtung folgt. In PCR- und Analyseräumen verwendete Materialien oder Reagenzien sollten niemals ohne gründliche Dekontaminierung in den PCR-Vorbereitungsraum gebracht werden.

Umweltproben, die Huminsäuren enthalten, können die PCR-Amplifikation hemmen und zu ungenauen Ergebnissen führen.

==Variationen==

* "Allel-spezifische PCR" oder "Amplification-Refractory-Mutation-System (ARMS)": eine Diagnose- oder Klonierungstechnik, die auf Einzelnukleotidvariationen (SNVs, nicht zu verwechseln mit SNPs) (Einzelbasenunterschiede bei einem Patienten) basiert. Jede Mutation, die eine Veränderung einer einzelnen Base beinhaltet, kann mit diesem System nachgewiesen werden. Es erfordert die vorherige Kenntnis einer DNA-Sequenz, einschließlich der Unterschiede zwischen Allelen, und verwendet Primer, deren 3'-Enden die SNV umfassen (Basenpaar-Puffer um die SNV herum ist normalerweise enthalten).  Die PCR-Amplifikation unter stringenten Bedingungen ist bei einer Fehlpaarung zwischen Matrize und Primer viel weniger effizient, sodass eine erfolgreiche Amplifikation mit einem SNP-spezifischen Primer das Vorhandensein des spezifischen SNP oder kleiner Deletionen in einer Sequenz anzeigt. Weitere Informationen finden Sie unter SNP-Genotypisierung.
* "Assembly PCR" oder "Polymerase Cycling Assembly (PCA)": künstliche Synthese langer DNA-Sequenzen durch PCR an einem Pool langer Oligonukleotide mit kurzen überlappenden Segmenten. Die Oligonukleotide wechseln zwischen der Sense- und Antisense-Richtung, und die überlappenden Segmente bestimmen die Reihenfolge der PCR-Fragmente, wodurch selektiv das endgültige lange DNA-Produkt hergestellt wird.
* "Asymmetrische PCR": Amplifiziert bevorzugt einen DNA-Strang in einer doppelsträngigen DNA-Vorlage. Sie wird bei der Sequenzierung und Hybridisierungsprobenahme eingesetzt, bei denen nur einer der beiden komplementären Stränge amplifiziert werden muss. Die PCR wird wie üblich durchgeführt, jedoch mit einem großen Überschuss an Primer für den Strang, der amplifiziert werden soll. Aufgrund der langsamen (arithmetischen) Amplifikation später in der Reaktion, nachdem der limitierende Primer aufgebraucht ist, sind zusätzliche PCR-Zyklen erforderlich. Eine aktuelle Modifikation dieses Verfahrens, bekannt als "L‚‘inear-‚‘A‚‘fter-‚‘T‚‘he-‚‘E‚‘xponential-PCR (LATE-PCR), verwendet einen limitierenden Primer mit einer höheren Schmelztemperatur (Tm) als der überschüssige Primer, um die Reaktionseffizienz aufrechtzuerhalten, wenn die Konzentration des limitierenden Primers in der Mitte der Reaktion abnimmt.
* "Konvektive PCR": eine pseudo-isotherme Methode zur Durchführung der PCR. Anstatt die PCR-Mischung wiederholt zu erhitzen und abzukühlen, wird die Lösung einem Temperaturgefälle ausgesetzt. Der daraus resultierende, durch thermische Instabilität angetriebene konvektive Fluss mischt die PCR-Reagenzien automatisch aus den heißen und kalten Bereichen und ermöglicht so wiederholt die PCR. Parameter wie thermische Randbedingungen und die Geometrie des PCR-Gehäuses können optimiert werden, um eine robuste und schnelle PCR zu erzielen, indem die Entstehung chaotischer Strömungsfelder genutzt wird. Eine solche PCR-Konfiguration mit konvektiver Strömung reduziert den Energiebedarf und die Betriebszeit des Geräts erheblich.
* "Dial-out PCR": eine hochparallele Methode zur Gewinnung genauer DNA-Moleküle für die Gensynthese. Eine komplexe Bibliothek von DNA-Molekülen wird vor der massiv parallelen Sequenzierung mit einzigartigen flankierenden Tags modifiziert. Tag-gesteuerte Primer ermöglichen dann die Gewinnung von Molekülen mit den gewünschten Sequenzen durch PCR.
* "Digitale PCR (dPCR)": wird verwendet, um die Menge einer Ziel-DNA-Sequenz in einer DNA-Probe zu messen. Die DNA-Probe wird stark verdünnt, sodass nach der parallelen Durchführung vieler PCRs einige von ihnen kein einziges Molekül der Ziel-DNA erhalten. Die Ziel-DNA-Konzentration wird anhand des Anteils der negativen Ergebnisse berechnet. Daher der Name "digitale PCR".
* "Helikase-abhängige Amplifikation": Ähnlich wie bei der herkömmlichen PCR, jedoch mit konstanter Temperatur statt zyklischer Denaturierung und Annealing/Extension. Anstelle der thermischen Denaturierung wird die DNA-Helikase eingesetzt, ein Enzym, das DNA entwindet.
* "Hot-Start-PCR": Eine Technik, die die unspezifische Amplifikation während der anfänglichen Einrichtungsphasen der PCR reduziert. Sie kann manuell durchgeführt werden, indem die Reaktionskomponenten vor der Zugabe der Polymerase auf die Denaturierungstemperatur (z. B. 95 °C) erhitzt werden. Es wurden spezielle Enzymsysteme entwickelt, die die Aktivität der Polymerase bei Umgebungstemperatur hemmen, entweder durch die Bindung eines Antikörpers oder durch die Anwesenheit kovalent gebundener Inhibitoren, die erst nach einem Aktivierungsschritt bei hoher Temperatur dissoziieren. Die Hot-Start/Cold-Finish-PCR wird mit neuen Hybrid-Polymerasen erreicht, die bei Umgebungstemperatur inaktiv sind und bei der Elongationstemperatur sofort aktiviert werden.
* "In-silico-PCR" (digitale PCR, virtuelle PCR, elektronische PCR, e-PCR) bezieht sich auf Rechenwerkzeuge, die zur Berechnung theoretischer Ergebnisse der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines bestimmten Satzes von Primern (Sonden) zur Amplifikation von DNA-Sequenzen aus einem sequenzierten Genom oder Transkriptom verwendet werden. Die In-silico-PCR wurde als Lehrmittel für die Molekularbiologie vorgeschlagen.
* "Intersequenz-spezifische PCR" (ISSR): eine PCR-Methode für den DNA-Fingerabdruck, die Regionen zwischen einfachen Sequenzwiederholungen amplifiziert, um einen eindeutigen Fingerabdruck der amplifizierten Fragmentlängen zu erzeugen.
* "Inverse PCR": wird häufig zur Identifizierung der flankierenden Sequenzen um genomische Inserts verwendet. Sie umfasst eine Reihe von DNA-Verdauungen und Selbstligierungen, die zu bekannten Sequenzen an beiden Enden der unbekannten Sequenz führen.
* "Ligation-vermittelte PCR": verwendet kleine DNA-Linker, die an die DNA von Interesse ligiert werden, und mehrere Primer, die an die DNA-Linker binden; sie wurde für die DNA-Sequenzierung, das Genom-Walking und das DNA-Footprinting verwendet.
* "Methylierungsspezifische PCR" (MSP): wurde von Stephen Baylin und James G. Herman an der Johns Hopkins School of Medicine entwickelt und wird zum Nachweis der Methylierung von CpG-Inseln in genomischer DNA verwendet. Die DNA wird zunächst mit Natriumbisulfit behandelt, das unmethylierte Cytosinbasen in Uracil umwandelt, das von PCR-Primern als Thymin erkannt wird. Anschließend werden zwei PCRs an der modifizierten DNA durchgeführt, wobei Primersätze verwendet werden, die bis auf CpG-Inseln innerhalb der Primersequenzen identisch sind. An diesen Stellen erkennt ein Primersatz DNA mit Cytosinen, um methylierte DNA zu amplifizieren, und ein Satz erkennt DNA mit Uracil oder Thymin, um unmethylierte DNA zu amplifizieren. MSP unter Verwendung von qPCR kann auch durchgeführt werden, um quantitative statt qualitative Informationen über die Methylierung zu erhalten.
* "Miniprimer PCR": verwendet eine thermostabile Polymerase (S-Tbr), die kurze Primer ("Smalligos") mit einer Länge von nur 9 oder 10 Nukleotiden verlängern kann. Diese Methode ermöglicht die PCR-Zielung auf kleinere Primer-Bindungsregionen und wird zur Amplifikation konservierter DNA-Sequenzen wie dem 16S (oder eukaryotischen 18S) rRNA-Gen verwendet.
* "Multiplex ligation-dependent probe amplification" (MLPA): ermöglicht die Amplifikation mehrerer Ziele mit einem einzigen Primerpaar, wodurch die Auflösungsbeschränkungen der Multiplex-PCR (siehe unten) vermieden werden.
* "Multiplex-PCR": besteht aus mehreren Primersätzen in einer einzigen PCR-Mischung, um Amplikons unterschiedlicher Größe zu erzeugen, die für verschiedene DNA-Sequenzen spezifisch sind. Durch die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Gene können in einem einzigen Testdurchlauf zusätzliche Informationen gewonnen werden, für die sonst ein Mehrfaches an Reagenzien und mehr Zeit erforderlich wäre. Die Annealingtemperaturen für jeden der Primersätze müssen optimiert werden, damit sie in einer einzigen Reaktion korrekt funktionieren, ebenso wie die Amplikongrößen. Das heißt, ihre Basenpaar-Länge sollte unterschiedlich genug sein, um bei der Visualisierung durch Gelelektrophorese unterschiedliche Banden zu bilden.
* "Nanopartikel-gestützte PCR (nanoPCR)": Einige Nanopartikel (NPs) können die Effizienz der PCR erhöhen (daher nanoPCR genannt), und einige können sogar die ursprünglichen PCR-Verstärker übertreffen. Es wurde berichtet, dass Quantenpunkte (QDs) die PCR-Spezifität und -Effizienz verbessern können. Einwandige Kohlenstoff-Nanoröhren (SWCNTs) und mehrwandige Kohlenstoff-Nanoröhren (MWCNTs) sind effizient bei der Verstärkung der Amplifikation von langen PCR. Kohlenstoffnanopulver (CNP) kann die Effizienz wiederholter PCR und langer PCR verbessern, während Zinkoxid, Titandioxid und Ag-NPs die PCR-Ausbeute erhöhen. Frühere Daten deuteten darauf hin, dass nichtmetallische NPs eine akzeptable Amplifikationstreue beibehalten. Da viele NPs in der Lage sind, die PCR-Effizienz zu steigern, ist es offensichtlich, dass es ein großes Potenzial für Verbesserungen der nanoPCR-Technologie und der Produktentwicklung gibt.
* "Nested PCR": erhöht die Spezifität der DNA-Amplifikation, indem der Hintergrund aufgrund unspezifischer DNA-Amplifikation reduziert wird. In zwei aufeinanderfolgenden PCRs werden zwei Primer-Sets verwendet. In der ersten Reaktion wird ein Primer-Paar verwendet, um DNA-Produkte zu erzeugen, die neben dem beabsichtigten Ziel noch aus unspezifisch amplifizierten DNA-Fragmenten bestehen können. Das/die Produkt(e) werden dann in einer zweiten PCR mit einem Satz Primer verwendet, deren Bindungsstellen sich vollständig oder teilweise von denen der in der ersten Reaktion verwendeten Primer unterscheiden und sich 3' von jedem der Primer befinden. Die verschachtelte PCR ist bei der spezifischen Amplifikation langer DNA-Fragmente oft erfolgreicher als die herkömmliche PCR, erfordert jedoch detailliertere Kenntnisse der Zielsequenzen.
* "Overlap-extension PCR" oder "Splicing by overlap extension (SOEing)": eine gentechnische Technik, die verwendet wird, um zwei oder mehr DNA-Fragmente, die komplementäre Sequenzen enthalten, zusammenzufügen. Sie wird verwendet, um DNA-Stücke, die Gene, regulatorische Sequenzen oder Mutationen enthalten, zu verbinden; die Technik ermöglicht die Erstellung spezifischer und langer DNA-Konstrukte. Sie kann auch Deletionen, Insertionen oder Punktmutationen in eine DNA-Sequenz einbringen.
* "PAN-AC": verwendet isotherme Bedingungen für die Amplifikation und kann in lebenden Zellen verwendet werden.
* "PAN-PCR": Ein computergestütztes Verfahren zur Entwicklung von Bakterien-Typisierungsassays auf der Grundlage von Daten der Gesamtgenomsequenz.
* "Quantitative PCR" (qPCR): wird zur Messung der Menge einer Zielsequenz verwendet (üblicherweise in Echtzeit). Sie misst die Ausgangsmenge von DNA, cDNA oder RNA quantitativ. Die quantitative PCR wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine DNA-Sequenz in einer Probe vorhanden ist und wie viele Kopien davon in der Probe vorhanden sind. Die "Quantitative PCR" hat einen sehr hohen Präzisionsgrad. Quantitative PCR-Methoden verwenden Fluoreszenzfarbstoffe wie Sybr Green, EvaGreen oder Fluorophor-haltige DNA-Sonden wie TaqMan, um die Menge des amplifizierten Produkts in Echtzeit zu messen. Sie wird manchmal auch als RT-PCR (Echtzeit-PCR) abgekürzt, aber diese Abkürzung sollte nur für die Reverse Transkriptions-PCR verwendet werden. qPCR ist die geeignete Abkürzung für quantitative PCR (Echtzeit-PCR).
* "Reverse-Complement-PCR" (RC-PCR): Ermöglicht die Zugabe von funktionellen Domänen oder Sequenzen der Wahl, die unabhängig voneinander an beide Enden des erzeugten Amplikons in einer einzelnen geschlossenen Reaktionsröhre angehängt werden. Diese Methode erzeugt zielspezifische Primer innerhalb der Reaktion durch die Interaktion von Universalprimern (die die gewünschten anzuhängenden Sequenzen oder Domänen enthalten) und RC-Sonden.
* "Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)": zur Amplifikation von DNA aus RNA. Reverse Transkriptase transkribiert RNA in cDNA, die dann durch PCR amplifiziert wird. RT-PCR wird häufig bei der Erstellung von Expressionsprofilen eingesetzt, um die Expression eines Gens zu bestimmen oder die Sequenz eines RNA-Transkripts zu identifizieren, einschließlich der Transkriptionsstart- und -terminierungsstellen. Wenn die genomische DNA-Sequenz eines Gens bekannt ist, kann die RT-PCR verwendet werden, um die Position von Exons und Introns im Gen zu kartieren. Das 5'-Ende eines Gens (das der Transkriptionsstartstelle entspricht) wird typischerweise durch RACE-PCR ("Rapid Amplification of cDNA Ends") identifiziert.
* "RNase H-abhängige PCR" (rhPCR): eine Modifikation der PCR, bei der Primer mit einem 3'-Verlängerungsblock verwendet werden, der durch ein thermostabiles RNase HII-Enzym entfernt werden kann.  Dieses System reduziert Primer-Dimere und ermöglicht die Durchführung von Multiplex-Reaktionen mit einer höheren Anzahl von Primern.
* {{anchor|SSP-PCR}}"Single specific primer-PCR" (SSP-PCR): ermöglicht die Amplifikation doppelsträngiger DNA, selbst wenn die Sequenzinformationen nur an einem Ende verfügbar sind. Diese Methode ermöglicht die Amplifikation von Genen, für die nur eine Teilsequenzinformation verfügbar ist, und erlaubt ein unidirektionales Genom-Walking von bekannten in unbekannte Regionen des Chromosoms.
* "Festphasen-PCR": umfasst mehrere Bedeutungen, darunter die Polony-Amplifikation (bei der PCR-Kolonien beispielsweise in einer Gelmatrix abgeleitet werden), die Brücken-PCR (Primer sind kovalent an eine feste Trägeroberfläche gebunden), die konventionelle Festphasen-PCR (bei der die asymmetrische PCR in Gegenwart eines festen Trägers angewendet wird, der Primer mit einer Sequenz trägt, die mit einem der wässrigen Primer übereinstimmt) und Enhanced Solid Phase PCR (bei der die konventionelle Festphasen-PCR durch die Verwendung von Primern mit hoher Tm und verschachtelten Festphasen-Primern mit optionaler Anwendung eines thermischen "Schritts" zur Förderung der Festphasen-Priming verbessert werden kann).
* "Suicide PCR": wird in der Regel in der Paläogenetik oder anderen Studien eingesetzt, bei denen die Vermeidung von falsch positiven Ergebnissen und die Sicherstellung der Spezifität des amplifizierten Fragments höchste Priorität haben. Sie wurde ursprünglich in einer Studie beschrieben, um das Vorhandensein des Bakteriums Yersinia pestis in Zahnproben zu überprüfen, die aus Gräbern aus dem 14. Jahrhundert von Menschen stammten, die vermutlich während der mittelalterlichen Pestepidemie durch die Pest getötet wurden. Die Methode schreibt vor, dass jede Primerkombination nur einmal in einer PCR verwendet werden darf (daher der Begriff "Suizid"), was bei einer positiven Kontroll-PCR-Reaktion niemals hätte der Fall sein dürfen, und die Primer sollten immer auf eine Genomregion abzielen, die noch nie zuvor im Labor mit diesem oder einem anderen Primersatz amplifiziert wurde. Dadurch wird sichergestellt, dass keine kontaminierende DNA aus früheren PCR-Reaktionen im Labor vorhanden ist, die sonst zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte.
* "Thermische asymmetrische Interlaced-PCR (TAIL-PCR)": zur Isolierung einer unbekannten Sequenz, die eine bekannte Sequenz flankiert. Innerhalb der bekannten Sequenz verwendet die TAIL-PCR ein verschachteltes Primerpaar mit unterschiedlichen Annealingtemperaturen; ein degenerierter Primer wird verwendet, um in die andere Richtung von der unbekannten Sequenz zu amplifizieren.
* "Touchdown-PCR" (auch "Step-down-PCR"): eine Variante der PCR, die darauf abzielt, den unspezifischen Hintergrund durch allmähliche Senkung der Annealingtemperatur im Verlauf des PCR-Zyklus zu reduzieren. Die Annealingtemperatur liegt bei den ersten Zyklen in der Regel einige Grad (3–5 °C) über dem T<sub>m</sub> der verwendeten Primer, während sie bei den späteren Zyklen einige Grad (3–5 °C) unter dem Primer-T<sub>m</sub> liegt. Die höheren Temperaturen sorgen für eine größere Spezifität bei der Primerbindung, und die niedrigeren Temperaturen ermöglichen eine effizientere Amplifikation der spezifischen Produkte, die während der ersten Zyklen gebildet wurden.
* Die Zwei-Enden-PCR ist eine von Professor Mikael Kubista entwickelte Technologie zur Amplifikation kurzer Matrizenmoleküle wie microRNA<nowiki/>s und noch kürzerer Moleküle unter Verwendung eines Haarnadel-Primers, der sowohl mit seinem 3'- als auch mit seinem 5'-Ende an das Ziel hybridisiert.
* "Universal Fast Walking": für das Genom-Walking und den genetischen Fingerabdruck unter Verwendung einer spezifischeren "zweiseitigen" PCR als herkömmliche "einseitige" Ansätze (unter Verwendung nur eines genspezifischen Primers und eines allgemeinen Primers – was zu Artefakten führen kann) durch einen Mechanismus, der die Bildung einer Lariatstruktur beinhaltet. Optimierte Derivate von UFW sind LaNe RAGE (lariat-abhängige verschachtelte PCR zur schnellen Amplifikation genomischer DNA-Enden), 5'RACE LaNe und 3'RACE LaNe.

==Geschichte==

[[File:Primers RevComp.svg|thumb|Diagrammatic representation of an example primer pair. The use of primers in an in vitro assay to allow DNA synthesis was a major innovation that allowed the development of PCR.]]

Die hitzebeständigen Enzyme, die eine Schlüsselkomponente in der Polymerase-Kettenreaktion darstellen, wurden in den 1960er Jahren als Produkt einer mikrobiellen Lebensform entdeckt, die in den überhitzten Gewässern der Mushroom Spring im Yellowstone-Nationalpark lebte.

In einer 1971 im "Journal of Molecular Biology" veröffentlichten Arbeit beschrieben Kjell Kleppe und Mitarbeiter aus dem Labor von H. Gobind Khorana erstmals eine Methode zur Verwendung eines enzymatischen Assays zur Replikation einer kurzen DNA-Vorlage mit Primern "in vitro". Diese frühe Manifestation des grundlegenden PCR-Prinzips fand damals jedoch nicht viel Beachtung, und die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion im Jahr 1983 wird allgemein Kary Mullis zugeschrieben.

[[File:Baby Blue - a prototype polymerase chain reaction (PCR), c 1986. (9663810586).jpg|thumb|right|"Baby Blue", a 1986 prototype machine for doing PCR]]
Als Mullis 1983 die PCR entwickelte, arbeitete er in Emeryville, Kalifornien, für die Cetus Corporation, eines der ersten Biotechnologieunternehmen, wo er für die Synthese kurzer DNA-Ketten verantwortlich war. Mullis schrieb, dass ihm die Idee für die PCR kam, als er eines Nachts mit dem Auto den Pacific Coast Highway entlangfuhr. Er spielte mit dem Gedanken an eine neue Methode zur Analyse von Veränderungen (Mutationen) in der DNA, als ihm klar wurde, dass er stattdessen eine Methode zur Vervielfältigung eines beliebigen DNA-Abschnitts durch wiederholte, von der DNA-Polymerase gesteuerte Vervielfältigungszyklen erfunden hatte. In "Scientific American" fasste Mullis das Verfahren zusammen: "Ausgehend von einem einzigen Molekül des genetischen Materials DNA kann die PCR an einem Nachmittag 100 Milliarden ähnliche Moleküle erzeugen. Die Reaktion ist einfach durchzuführen. Man benötigt nicht mehr als ein Reagenzglas, ein paar einfache Reagenzien und eine Wärmequelle." Der DNA-Fingerabdruck wurde erstmals 1988 für Vaterschaftstests verwendet.

Mullis schreibt LSD eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der PCR zu: "Hätte ich die PCR erfunden, wenn ich kein LSD genommen hätte?  Das bezweifle ich ernsthaft.  Ich konnte auf einem DNA-Molekül sitzen und zusehen, wie die Polymere vorbeizogen.  Das habe ich zum Teil durch psychedelische Drogen gelernt."

Mullis und der Biochemiker Michael Smith, der andere wichtige Methoden zur DNA-Manipulation entwickelt hatte, erhielten 1993 gemeinsam den Nobelpreis für Chemie, sieben Jahre nachdem Mullis und seine Kollegen bei Cetus seinen Vorschlag erstmals in die Praxis umgesetzt hatten. Mullis' 1985 gemeinsam mit R. K. Saiki und H. A. Erlich verfasste Arbeit "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" – die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – wurde 2017 von der Abteilung für Geschichte der Chemie der American Chemical Society mit einem Citation for Chemical Breakthrough Award ausgezeichnet.

Das Herzstück der PCR-Methode ist die Verwendung einer geeigneten DNA-Polymerase, die den hohen Temperaturen (>{{convert|90|°C|°F|abbr=on}}) standhält, die für die Trennung der beiden DNA-Stränge in der DNA-Doppelhelix nach jedem Replikationszyklus erforderlich sind. Die DNA-Polymerasen, die ursprünglich für In-vitro-Experimente eingesetzt wurden, die die PCR vorwegnahmen, waren diesen hohen Temperaturen nicht gewachsen. Daher waren die frühen Verfahren zur DNA-Replikation sehr ineffizient und zeitaufwendig und erforderten große Mengen an DNA-Polymerase und eine kontinuierliche Handhabung während des gesamten Prozesses.

Die Entdeckung der Taq-Polymerase im Jahr 1976 – eine DNA-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium "Thermus aquaticus" gewonnen wurde, das natürlicherweise in heißen ({{convert|50|to|80|C|F}}) Umgebungen wie heißen Quellen lebt – ebnete den Weg für dramatische Verbesserungen der PCR-Methode. Die aus "T. aquaticus" isolierte DNA-Polymerase ist bei hohen Temperaturen stabil und bleibt auch nach der DNA-Denaturierung aktiv, sodass nicht nach jedem Zyklus neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden muss. Dies ermöglichte ein automatisiertes, auf Thermocyclern basierendes Verfahren zur DNA-Amplifikation.

===Patentstreitigkeiten===
Die PCR-Technik wurde von Kary Mullis patentiert und der Cetus Corporation übertragen, bei der Mullis arbeitete, als er die Technik 1983 erfand. Das "Taq"-Polymerase-Enzym war ebenfalls durch Patente geschützt. Es gab mehrere hochkarätige Gerichtsverfahren im Zusammenhang mit der Technik, darunter eine erfolglose Klage von [[DuPont]]. Das Schweizer Pharmaunternehmen Hoffmann-La Roche erwarb 1992 die Rechte an den Patenten. Das letzte der kommerziellen PCR-Patente lief 2017 aus.

Ein damit zusammenhängender Patentstreit um das "Taq"-Polymeraseenzym zwischen Roche und Promega ist noch immer in mehreren Gerichtsbarkeiten weltweit anhängig. Die rechtlichen Auseinandersetzungen dauern über die Laufzeit der ursprünglichen PCR- und "Taq"-Polymerase-Patente hinaus an, die am 28. März 2005 ausliefen.

== Externe Links ==
{{Commons|Polymerase chain reaction}}

* [http://patft.uspto. gov/netacgi/nph-Parser?Sect2=PTO1&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&l=50&d=PALL&RefSrch=yes&Query=PN%2F4683202 US-Patent für PCR]
* [https://www.youtube.com/watch?v=rbvvvLWE8jI Was ist der PCR-Plateau-Effekt?] YouTube-Tutorial-Video
* [http://siarchives.si.edu/collections/siris_arc_217745 Geschichte der Polymerase-Kettenreaktion] aus den Smithsonian Institution Archives
* {{Cite AV media |url=https://www.youtube.com/watch?v=zaXKQ70q4KQ |title=The Man Who Took LSD and Changed The World |date=2024-12-26 |last=Veritasium |access-date=2025-01-29 |via=YouTube}}

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